高速離心機(jī)分離的幾種方法

　　制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法：
 

　　A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。
 

　　差速離心是一種常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時(shí)間的離心后，就可得到兩個(gè)部份：沉淀和上清液。
 

　　通常在第1次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng)，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止。
 

　　差速離心的特點(diǎn)是操作簡單，但分離純度不高。
 

　　B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離，具有很好的分辨率。
 

　　1)速率區(qū)帶法(ratezonal)：
 

　　根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下：
 

　　在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。
 

　　將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。
 

　　由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會(huì)形成幾條分開的樣品區(qū)帶。
 

　　注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。
 

　　2)等密度離心法(isopycnic)：
 

　　根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。
 

　　密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定，與時(shí)間無關(guān)，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對位置。2.密度梯度分析法
 

　　1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：
 

　　A、應(yīng)具備的性質(zhì)：
 

　　梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：
 

　　·所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。
 

　　·具有某些性質(zhì)，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。
 

　　·所形成的溶液粘度低。
 

　　·不損傷所分離的樣品。
 

　　·離心分離后容易除去。
 

　　·不妨礙分離積分的分析。
 

　　B、常用介質(zhì)種類：
 

　　表一、常用梯度材料在20℃密度
 

　　B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍：
 

　　表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用
 

　　+++很好++好+可以--不適用
 

　　表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度
 

　　(2)、梯度溶液的準(zhǔn)備：
 

　　計(jì)算
 

　　稀釋(本文第三章第1部分)
 

　　(3)、梯度形狀
 

　　梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。(如下圖)
 

　　梯度形狀對于分離是否成功非常重要：
 

　　常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動(dòng)物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。
 

　　B.梯度柱制備：
 

　　梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
 

　　半注法：
 

　　為縮減離心時(shí)間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。
 

　　(4)、加樣方法與加樣量：
 

　　將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對于DNA一類易斷的脆弱樣品，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱小密度的1/10(W/W)。
 

　　(5)、轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：
 

　　(6)、分離區(qū)帶的回收及檢測
 

　　離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：
 

　　a.穿刺法
 

　　穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。
 

　　b.虹吸法：
 

　　將一毛細(xì)管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動(dòng)，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。
 

　　c.加壓法：
 

　　通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。
 

　　d.切割法：
 

　　采用的切割刀切割所需區(qū)帶。
 

　　圖片
 

　　區(qū)帶檢測：
 

　　所謂區(qū)帶檢測，實(shí)際上是對水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測，通常只是測量在260或280mm時(shí)長的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布，這個(gè)操作通常稱之為在線(online)監(jiān)測。
 

　　如何正確維護(hù)你的離心機(jī)
 

　　離心機(jī)的發(fā)展離心機(jī)是將樣品進(jìn)行分離的儀器，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、石油化工、農(nóng)業(yè)、食品衛(wèi)生等領(lǐng)域。離心機(jī)自問世以來，歷經(jīng)低速、調(diào)整、超速的變遷，其進(jìn)展主要體現(xiàn)在離心設(shè)備和離心技術(shù)兩方面，二者相輔相成。從轉(zhuǎn)速看，臺式離心機(jī)基本屬于低速、高速離心機(jī)的范疇，通用臺式離心機(jī)的發(fā)展已經(jīng)模糊了低速、高速、微量和大容量離心機(jī)的界線，眾多的轉(zhuǎn)頭為科研人員提供相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，成為科研實(shí)驗(yàn)室機(jī)型。
 

　　離心機(jī)原理
 

　　利用離心力，根據(jù)混合物中各組分沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等的不同原理，將樣品混合物中的液體與固體顆?；蛞后w與液體分離出來。
 

　　離心機(jī)分類
 

　　離心機(jī)是實(shí)驗(yàn)室極常見的分離儀器按轉(zhuǎn)速可分為低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)等；
 

　　常速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速小于3500r/min
 

　　高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速在3500r/min~50000r/min之間
 

　　超高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于50000r/min。
 

　　按溫度可分為冷凍離心機(jī)、常溫離心機(jī)；
 

　　按容量可分為微量離心機(jī)、大容量離心機(jī)、超大容量離心機(jī)；
 

　　按外型可分為臺式離心機(jī)、落地式離心機(jī)。
 

　　使用守則
 

　　使用離心機(jī)首重安全，離心力失控可能造成很大的破壞。因此要注意離心管是否平衡，轉(zhuǎn)速是否超過設(shè)置，轉(zhuǎn)子是否有腐蝕等。
 

　　離心機(jī)使用起來看似簡單，沒有技術(shù)含量，但是正確的使用及維護(hù)還是很有必要，一旦發(fā)生故障，對實(shí)驗(yàn)造成延誤，也是得不償失。
 

　　一.離心機(jī)在預(yù)冷狀態(tài)時(shí)，離心機(jī)蓋必須關(guān)閉，離心結(jié)束后取出的轉(zhuǎn)頭要倒置于實(shí)驗(yàn)臺上，擦干腔內(nèi)余水，此時(shí)離心機(jī)蓋處于打開狀態(tài)。
 

　　二.轉(zhuǎn)頭在預(yù)冷時(shí)轉(zhuǎn)頭蓋可擺放在離心機(jī)的平臺上，或擺放在實(shí)驗(yàn)臺上，千萬不可不擰緊浮放在轉(zhuǎn)頭上，因?yàn)橐坏┱`啟動(dòng)，轉(zhuǎn)頭蓋就會(huì)飛出，造成事故！
 

　　三.轉(zhuǎn)頭蓋在擰緊后一定要用手指觸摸轉(zhuǎn)頭與轉(zhuǎn)蓋之間有無縫隙，如有縫隙要擰開重新擰緊，直至確認(rèn)無縫隙方可啟動(dòng)離心機(jī)。
 

　　四.在離心過程中，操作人員不得離開離心機(jī)室，一旦發(fā)生異常情況操作人員不能關(guān)電源(POWER)，要按STOP。在預(yù)冷前要填寫好離心機(jī)使用記錄。
 

　　五.不得使用偽劣的離心使管，不得用老化、變形、有裂紋的離心管。
 

　　六.在節(jié)假日和晚間后一個(gè)使用離心機(jī)須例行安全檢查后方能離去。
 

　　七.在儀器使用過程中發(fā)生機(jī)器故障，部件損壞情況時(shí)要及時(shí)與生產(chǎn)廠家聯(lián)系
 

　　使用注意
 

　　實(shí)驗(yàn)室常用的是電動(dòng)離心機(jī)電動(dòng)離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)速度快，要注意安全，特別要防止在離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)期間，因不平衡或試管墊老化，而使離心機(jī)邊工作邊移動(dòng)，以致從實(shí)驗(yàn)臺上掉下來，或因蓋子未蓋，離心管因振動(dòng)而破裂后，玻璃碎片旋轉(zhuǎn)飛出，造成事故。因此使用離心機(jī)時(shí)，必須注意以下操作。
 

　　(1)離心機(jī)套管底部要墊棉花或試管墊。
 

　　(2)電動(dòng)離心機(jī)如有噪音或機(jī)身振動(dòng)時(shí)，應(yīng)立即切斷電源，即時(shí)排除故障。
 

　　(3)離心管必須對稱放入套管中，防止機(jī)身振動(dòng)，若只有一支樣品管另外一支要用等質(zhì)量的水代替。
 

　　(4)啟動(dòng)離心機(jī)時(shí)，應(yīng)蓋上離心機(jī)頂蓋后，方可慢慢啟動(dòng)。
 

　　(5)分離結(jié)束后，先關(guān)閉離心機(jī)，在離心機(jī)停止轉(zhuǎn)動(dòng)后，方可打開離心機(jī)蓋，取出樣品，不可用外力強(qiáng)制其停止運(yùn)動(dòng)。
 

　　(6)離心時(shí)間一般1～2分鐘，在此期間，實(shí)驗(yàn)者不得離開去做別的事。
 

　　電動(dòng)使用注意問題
 

　　在企業(yè)或院校研究機(jī)構(gòu)中，轉(zhuǎn)速在3000轉(zhuǎn)左右的低速實(shí)驗(yàn)離心機(jī)已經(jīng)比較常用，如315型過濾+沉降一體式實(shí)驗(yàn)離心機(jī)，100型實(shí)驗(yàn)離心機(jī)，200型實(shí)驗(yàn)離心機(jī)等。這些離心機(jī)設(shè)計(jì)合理，重心低，安全穩(wěn)定，在化工、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域的前期試樣分析中得到了更大的應(yīng)用。
 

　　操作方法
 

　　1、使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過各個(gè)離心機(jī)說明書上所規(guī)定的范圍，每個(gè)離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。
 

　　2、若要在低于室溫的溫度下離心時(shí)。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。
 

　　3、離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時(shí)觀察離心機(jī)上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機(jī)檢查，及時(shí)排除故障。
 

　　4、每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其高允許轉(zhuǎn)速和使用累積*，使用轉(zhuǎn)頭時(shí)要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時(shí)間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的高使用*，則須按規(guī)定降速使用。
 

　　5、裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。
 

　　日常保養(yǎng)
 

　　轉(zhuǎn)子
 

　　離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)前應(yīng)先切斷電源并先松開離心機(jī)剎車，可以手試轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)鼓，看有無咬煞情況。
 

　　檢查其他部位有無松動(dòng)及不正常情況。
 

　　接通電源依順時(shí)針方向開車啟動(dòng)(通常從靜止?fàn)顟B(tài)到正常運(yùn)轉(zhuǎn)約需40-60秒左右)。
 

　　通常每臺設(shè)備到廠后均須空車運(yùn)轉(zhuǎn)3小時(shí)左右，無異常情況即可工作。
 

　　物料盡可能要放置均勻。
 

　　必須專人操作，容量不得超過額定量。
 

　　嚴(yán)禁機(jī)器超速運(yùn)轉(zhuǎn)，以免影響機(jī)器使用壽命。
 

　　機(jī)器開動(dòng)后，若有異常情況必須停車檢查，必要時(shí)需予以拆洗修理。
 

　　離心機(jī)工作時(shí)是高速運(yùn)轉(zhuǎn)，因此切不可用身體觸及其轉(zhuǎn)鼓，以防意外。
 

　　濾布的目數(shù)應(yīng)根據(jù)所分離物料的固相顆粒的大小而定，否則影響分離效果。另外濾布安裝時(shí)應(yīng)將濾布
 

　　密封圈嵌入轉(zhuǎn)鼓密封槽內(nèi)，以防物料跑入。
 

　　為確保離心機(jī)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)動(dòng)部件請每隔6個(gè)月后加油保養(yǎng)一次。同時(shí)查看軸承處運(yùn)轉(zhuǎn)潤滑情況，有無磨損現(xiàn)象；制動(dòng)裝置中的部件是否有磨損情況，嚴(yán)重的予以更換；軸承蓋有無漏油情況。
 

　　機(jī)器使用完畢，應(yīng)作好清潔工作，保持機(jī)器整潔。
 

　　不要將非防腐型離心機(jī)與于高腐蝕性物料的分離；另外嚴(yán)格按照設(shè)備要求、規(guī)定操作，非防爆型離心機(jī)切不可用于易燃、易爆場合。
 

　　“喘振”
 

　　制冷離心式機(jī)組的離心機(jī)常發(fā)生“喘振”現(xiàn)象。
 

　　制冷離心壓縮機(jī)原理是將大分子量的制冷劑通過高速運(yùn)動(dòng)將其積壓到小的空間進(jìn)行壓縮，然后通過降溫進(jìn)行冷凝。
 

　　離心式冷水機(jī)組能量調(diào)節(jié)方式是靠調(diào)節(jié)高速轉(zhuǎn)動(dòng)的導(dǎo)片角度來調(diào)節(jié)壓縮比
 

　　當(dāng)供冷量下降的時(shí)候，導(dǎo)片做的功降低，壓縮出去的氣體壓力和吸入壓縮機(jī)的氣體壓力相近，導(dǎo)致氣體回流產(chǎn)生機(jī)械的強(qiáng)迫震動(dòng)。(也稱“喘振”)喘振會(huì)造成機(jī)械部件的損壞。